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Opinión del experto

La técnica MACS mejora el potencial de fecundación de los espermatozoides

By 26/01/2016No Comments

La técnica MACS mejora el potencial de fecundación de los espermatozoides

La preparación del semen por la técnica MACS mejorar el potencial de fecundación de los espermatozoides al reducir los espermatozoides con marcadores apoptóticos y mejorar la reacción acrosómica en parejas con infertilidad sin causa aparente o esterilidad de origen desconocido.

Las parejas con infertilidad sin causa aparente (IU) presentan bajas tasas de fertilización. En este estudio se ha intentado identificar los espermatozoides con marcadores apoptóticos en parejas con IU y con inseminaciones intrauterinas sin éxito, para analizar la eficacia y beneficio de la técnica de selección celular inmunomagnética (MACS).

Se estudian las muestras de semen de 60 parejas, éstas se prepararon mediante gradientes de densidad (DGC), y se dividieron en 2 alícuotas una de ellas se usó de control y en la otra se realizó la MACS. El potencial de fecundación de los espermatozoides se analizó mediante análisis básico de semen, análisis computarizado y el test de inducción de la reacción acrosómica (IART).

El número de espermatozoides con marcadores apoptóticos se redujo significativamente en las muestras donde se realizó MACS (p<0,001). La IART también mejoró significativamente después de realizar MACS. Estos resultados revelan que la técnica MACS y la identificación de marcadores apoptóticos pueden ser útiles en el manejo de parejas con IU y fallos de IA.

Tsung-Hsien Lee 1,2,3, Chung-Hsien Liu 2, Yang-Tse Shih 2, Hui-Mei Tsao 4, Chun-Chia Huang 4, Hsiu-Hui Chen 4 and Maw-Sheng Lee 1,2,4,5

1 Institute of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, Taiwan.
2 Department of Obstetrics Gynecology, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, Taiwan.
3 Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan 4 Division of Infertility Clinic, Lee Women’s Hospital, Taichung, Taiwan.

Preparación del semen mediante MACS

INTRODUCCIÓN
La Infertilidad sin causa aparente (IU) o Esterilidad de origen desconocido (EOD) es un diagnóstico de exclusión después de una evaluación completa de la pareja donde se realiza un seminograma, pruebas de ovulación y de permeabilidad de las trompas y no se detecta ninguna alteración.

Se ha comprobado que la calidad del esperma necesario para el éxito de la inseminación artificial (IA) es inferior a los valores de referencia establecidos por las OMS que evalúan el potencial de fertilidad masculina. Sin embargo, si es relevante la fragmentación de ADN en los espermatozoides para el éxito de la IA en parejas infértiles, siendo el 41% de ellas con EOD. (Duran et al., 2002).

Para tratar a parejas con IU y con fallos de IA, se requiere una nueva evaluación de las propiedades biológicas de los espermatozoides como son los marcadores apoptóticos, fragmentación del ADN y pruebas funcionales como la unión del espermatozoide a la zona pelúcida o el test de la reacción acrosómica.

Los laboratorios han desarrollado nuevas técnicas para la preparación de las muestras seminales como la técnica MACS (Separación Magnética por Columnas de Anexina V), donde se conjugan microbolas magnéticas junto con la proteína Anexina V para eliminar aquellos espermatozoides que están destinados a morir. Estos espermatozoides apoptóticos tienen su membrana plasmática deteriorada ya que ha tenido lugar la externalización de la fosfatidilserina (EPS), uno de los primeros procesos que ocurren en las células apoptóticas.

OBJETIVO

La finalidad del estudio es investigar la incidencia de espermatozoides con marcadores apoptóticos y analizar la eficacia de la técnica MACS.

El potencial de fertilización de los espermatozoides se analizará mediante el sistema CASA y el test de la reacción acrosómica inducida (IART).

MATERIAL Y MÉTODOS

Selección de pacientes

El estudio inicial de fertilidad de aquellas pacientes que buscan tratamiento incluye el análisis de semen, histerosalpingografía o laparoscopia para la permeabilidad tubárica y niveles séricos de prolactina, estradiol, testosterona, FSH, LH y TSH.

Los criterios de inclusión en el estudio fueron mujeres que ovulan con conductos permeables, presencia de ovarios bilaterales, sin trastornos endocrinos (SOP ohiperprolactinemia) y pareja masculina con parámetros seminales normales. El análisis de semen se realizó bajo los criterios de la OMS (1999).

Respecto al tratamiento a seguir, las mujeres fueron estimuladas con citrato de clomifeno y FSHr hasta alcanzar un diámetro folicular de 18 mm; la inseminación se realizó a las 18-24h posteriores a la administración de la hCG.

Recogida y preparación de las muestras de semen

Se recogieron las 60 muestras de semen el mismo día del ensayo Hemizona. Éstas se prepararon mediante centrifugación por gradientes de densidad al 90 y 45% (DGC).

Una alícuota sirvió de control y la otra fue sometida a MACS. Los espermatozoides se incubaron con Anexina V conjugada con microbolas magnéticas durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después se hizo pasar la muestra por una columna de separación que contenía bolas de hierro imantadas. Se obtuvieron 2 fracciones: una compuesta por los espermatozoides apoptóticos (anexina-positivo) y otra con aquellos que pasaron la columna (anexina-negativos). En ambas fracciones se evaluaron los siguientes marcadores apoptóticos:

EPS: La anexina-V es una proteína de unión fosfolipídica que tiene una alta afinidad por la fosfatildilserina (PS). La translocación de la PS de la membrana interna a la externa es un hecho temprano de la apoptosis. La unión de la anexina-V cuando se externaliza PS muestra una mancha de color verde fluorescente.

Integridad del potencial de membrana mitocondrial (MMP): Para determinar la integridad funcional de los espermatozoides mitocondriales (MMP) se usó un sensor de membrana mitocondrial que permitió la detección de cambios en el potencial de la membrana mitocondrial durante las primeras etapas de la apoptosis.

Fragmentación del ADN: La fragmentación del ADN se evaluó mediante el test TUNEL. Se analizaron unas 10.000 células, la presencia de señales verdes fluorescentes se consideraron como positivas.

Para evaluar las características de la movilidad espermática se uso el sistema CRISMAS (Copenhagen, Dinamarca).

Ensayos hemizona

Para el ensayo se incubaron ovocitos y espermatozoides durante 4 horas a 37ºC y 5% CO2. Después se contaron los espermatozoides unidos fuertemente a la zona pelúcida y los resultados se expresaron como un índice Hemizona (HZI), HZI>36% fue considerado como un indicador potencial de fertilización.

Test de la reacción acrosómica inducida (IART) ▬

Después de incubar las muestras de semen, el estado de los acrosomas de los espermatozoides fue evaluado por tinción con FITC-PNA (Sigma; Gearon et al., 1994).
Se identificaron tres tipos de espermatozoides: con acrosoma intacto, acrosoma parcialmente reaccionado y con reacción acrosómica.

RESULTADOS

Se estudiaron un total de 60 pacientes con infertilidad sin causa aparente (IU) y con al menos dos inseminaciones fallidas. La media de los parámetros seminales se consideró normal bajo los criterios de la OMS.

Se comparó por citometría de flujo el porcentaje de marcadores apoptóticos (EPS, MMP y fragmentación de ADN) de ambas muestras, las preparadas por sólo DGC (centrifugación por gradientes de densidad) y aquellas por D+M (DGC+MACS).

El porcentaje de marcadores tempranos de la apoptosis, tales como EPS y MMP, en las muestras preparadas con MACS se redujo significativamente, al igual que el número de espermatozoides con fragmentación del ADN donde se retiró una cuarta parte. Aproximadamente el 30% de los espermatozoides con marcadores apoptóticos se eliminaron con técnica MACS.

El porcentaje de movilidad de aquellos espermatozoides preparados con MACS, disminuyó significativamente de 79,3% a 67% (p<0,005). Aún así no todas las características de movimiento analizadas por CRISMAS se modificaron. La movilidad del esperma se asoció estrechamente con EPS y fragmentación del ADN. También se vio aumentada la proporción de espermatozoides con la reacción acrosómica inducida (IART) después de utilizar MACS (33,5% frente a 24,7%; p<0,001). DISCUSIÓN

Se ha observado que los espermatozoides eyaculados presentan cambios a consecuencia de la apoptosis en las células somáticas tales como la externalización de la fosfatidilserina (EPS), cambios en la integridad del potencial de membrana mitocondrial (MMP) y fragmentación del ADN. En el semen de parejas subfértiles, una media del 20% de los espermatozoides presentan EPS.

La capacitación espermática por gradientes de densidad (DGC), normalmente utilizadas en los laboratorios de TRA, no elimina completamente los espermatozoides con marcadores de apoptosis (Henkel and Schill, 2003). Los datos también confirmaron la presencia de marcadores apoptóticos en los espermatozoides preparados por DGC para donantes sanos o las parejas subfértiles.

El esperma de las parejas con esterilidad de causa desconocida y con dos intentos de inseminación fallidos presenta una mayor proporción de ADN fragmentado, junto con otros marcadores apoptóticos.

La técnica de preparación de semen por selección celular inmunomagnética (“Magnetic-activated cell sorting”, MACS), combinada con DGC permite eliminar los espermatozoides de mala calidad, tanto inmaduros como con marcadores apoptóticos (Said et al., 2005). Aunque la movilidad de los espermatozoides puede verse afectada por esta técnica, la mayoría de las características de movimiento no se ven afectadas.

En este estudio la técnica de MACS disminuyó la EPS en un 25% y la perturbación del potencial de membrana mitocondrial en un 32%.

FUENTE: REPRODUCCIONASISTIDA.ORG

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